El ADN es una molécula que constituye el material genético de muchos de los organismos que habitan en el planeta tierra. La secuencia de nucleótidos del ADN compone la información genética propia del organismo y es única para cada uno de ellos. Por tanto, si determinamos esta secuencia en una muestra podemos llegar a determinar el organismo al que pertenece. Sin embargo, la cantidad o número de copias de ADN dentro de una muestra es generalmente bajo, lo cual dificulta enormemente su detección y caracterización.
La reacción en cadena de la polimerasa, llamada PCR de forma abreviada por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica que permite la amplificación exponencial de un fragmento de ADN de interés. Es decir, a partir de un bajo número de copias de ese fragmento, tras la reacción de PCR, se obtienen millones de copias que ya son fácilmente detectables en el laboratorio.
La PCR fue inventada por Kary Mullis en 1986 y le valió el premio Nobel en 1993. Hemos hablado muchas veces de la utilidad de esta técnica en el diagnóstico de enfermedades infecciosas como por ejemplo por el virus de la inmunodeficiencia humana o VIH. Pero, ¿cómo funciona esta técnica?¿qué otras aplicaciones tiene?
La reacción de PCR requiere la presencia de ADN molde, cebadores, nucleótidos y ADN polimerasa. La ADN polimerasa es la enzima clave que utilizando el ADN molde hace una copia de este mediante la incorporación de nucleótidos de forma secuencial en el producto de la PCR. Los nucleótidos adenina, timina, citosina y guanina son los bloques de la nueva copia resultante. Los cebadores u oligonucleótidos son los que confieren especificidad a la reacción ya que son fragmentos cortos de ADN con una secuencia definida complementaria al ADN diana que quiere ser amplificado. La ADN polimerasa utiliza los cebadores como punto de inicio de la polimerización del nuevo fragmento de ADN.
Los componentes de la PCR se mezclan en un tubo de ensayo y luego se colocan en una máquina que permite que se produzcan ciclos repetidos de amplificación de ADN. La máquina es un termociclador que un bloque térmico con agujeros, en el que se insertan los tubos. El termociclador eleva y baja la temperatura del bloque en tres etapas básicas preprogramadas. La reacción se calienta por primera vez por encima del punto de desnaturalización de las dos cadenas de ADN complementarias del ADN diana, lo que permite que las hebras se separen. A continuación se baja la temperatura para permitir que los cebadores específicos se unan a los segmentos de ADN diana, un proceso conocido como hibridación. La temperatura se eleva de nuevo hasta una temperatura en la cual la ADN polimerasa es capaz de extender los cebadores añadiendo nucleótidos a la hebra de ADN que se está construyendo. Con cada repetición de estos tres pasos, el número de moléculas de ADN copiadas se duplica. Tras 30-40 ciclos a partir de una única copia de ADN se pueden obtener más de mil millones de copias de un gen y en un tiempo record.
La PCR es una técnica que ha sido y es utilizada a diario en investigación científica. De hecho en algunas áreas de investigación la PCR supuso un antes y un después. Por nombrar algunas de las aplicaciones:
- Los genes amplificados por la PCR se pueden utilizar para incorporarlos en otros ADN (p.e. en vectores de expresión) en un proceso que se llama clonaje. Estos nuevos híbridos de ADN se pueden introducir en un organismo. Un ejemplo es la creación de recombinantes para la producción del factor VIII de coagulación humano.
- La PCR permite cuantificar la expresión génica de la célula en distintas condiciones. Se puede analizar la expresión de un determinado gen mediante PCR cuantitativa a tiempo real o la expresión global del genoma mediante técnicas de secuenciación masiva en las cuales la PCR juega un papel muy importante.
- Cuando se quiere conocer la función de un gen o actividad de una proteína, la PCR facilita la obtención de variantes mutantes (conocida como mutagénesis). En concreto, se puede mutar un determinado sitio del gen (mutagenesis dirigida) u obtener gran cantidad de variantes de un gen por mutagenesis al azar.
- La PCR permite analizar ADN procedente de muestras de miles e incluso millones de años de antigüedad, como las procedentes de momias, mamuts y fósiles. ¿Llegaremos a ver algún día dinosaurios como en Jurassic Park?
Pero la PCR además es válida para diferentes aplicaciones médicas que requieren una elevada cantidad de un fragmento concreto de ADN:
- Dado que la secuencia de nucleótidos de ADN es característica de cada persona, permite identificar a un individuo a partir de una muestra o averiguar su parentesco con otros. Curiosamente, estas aplicaciones de la PCR no son tan desconocidas por la Sociedad como otras ya que se han mostrado en multitud de ocasiones en películas y series de televisión como CSI, Bones, Mentes Criminales y otras. Por ejemplo, la huella digital genética permite relacionar a un sospechoso con una muestra obtenida en la escena de un crimen. Otro ejemplo, son los test de paternidad en los cuales se compara el ADN del niño con de los verdaderos y/o presuntos padres. En estos casos, la PCR se utiliza para aumentar la cantidad de ADN que luego será comparado.
- Identificar mutaciones en la secuencia de nucleótidos de una persona que puedan ser la causa de diversas patologías con base genética. En este grupo no solo encontramos el diagnóstico de enfermedades hereditarias sino que otras como el cáncer también están causadas por alteraciones en el genoma.
- Teniendo en cuenta su extrema sensibilidad, la PCR permite detectar la presencia de material genético de microorganismos en una muestra. Esto por un lado permite el diagnóstico de infecciones y por el otro ayuda a comprobar la eficacia de un determinado tratamiento frente a esa infección. Empíreo Diagnóstico Molecular es un laboratorio pionero en el uso de la PCR para el diagnóstico de enfermedades infecciosas como VIH (La PCR una solución eficaz en la detección de infecciones en fases tempranas o asintomáticas como el virus del Ébola). De hecho, llevamos más de 12 años utilizando esta técnica para detectar de forma precoz infecciones por este virus y por otros microorganismos causantes de enfermedades de transmisión sexual como hepatitis virales (Hepatitis C. Prevenir, diagnosticar, curar), sífilis (¿Por qué el diagnóstico temprano de sífilis puede marcar la diferencia?), gonorrea y clamidia.
En resumen, la PCR es un proceso sencillo y ampliamente utilizado en el que cantidades minúsculas de ADN pueden amplificarse en millones de copias con una gran la rapidez. Además, es capaz de cuantificar la cantidad una ADN en una muestra. Actualmente, las principales mejoras se basan en incrementar la velocidad y en la automatización del proceso para que los pacientes tengan los resultados en un tiempo mucho más reducido y mejorar su calidad de vida (Diagnosticar VIH de forma precoz evita nuevos contagios y permite establecer tratamientos que mejoran la calidad de vida).
Elaboración propia. Dr. Enrique Álvarez
