¿Qué es la PCR?

La PCR amplía sus dominios

EDUARDO LÓPEZ COLLAZO

Unidad de Investigación del Hospital Universitario La Paz, de Madrid

El autor de la tribuna analiza la evolución que ha sufrido la técnica diagnóstica de reacción en cadena de la polimerasa, que nació como una herramienta de biología molecular y que poco a poco ha ido ampliando sus indicaciones, siendo clave en la identificación de virus y retrovirus.

Desde que Kary B. Mullis inventara la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), a principios de la década de 1980, en el horizonte de este campo ha ido apareciendo una gran cantidad de aplicaciones al diagnóstico clínico. Esta técnica ha tenido tanta influencia en el desarrollo de la biología y, por consiguiente, en la medicina, como el descubrimiento de la estructura de doble hélice del material genético (ADN). El hecho de poder amplificar mínimas cantidades de ADN de manera específica ha propiciado su aplicación en la detección de microorganismos difíciles de cultivar, infecciones virales recientes, polimorfismos que causan enfermedades y marcadores de cáncer, entre otras muchas aplicaciones. Hoy por hoy, la medicina no puede caminar sin ella.

Explotando la función original de las polimerasas -enzimas cuya actividad es copiar secuencias de ADN, esta técnica nos permite realizar un fotocopiado molecular de una parte del material genético. Por ello, la presencia de ínfimas cantidades de una secuencia específica, como por ejemplo la secuencia que caracteriza a un virus, se puede amplificar hasta hacerla visible y, por lo tanto, detectable. En un principio la PCR sólo era aplicable a la detección de ADN; sin embargo, utilizando un paso previo y con ayuda de las retrotranscriptasas, podemos detectar también ARN, que es el material genético presente en los llamados retrovirus, como el VIH o la hepatitis C. Esta variación es conocida como RT-PCR (Retrotranscriptase Polymerase Chain Reaction).

La amplificación de una porción del material genético perteneciente a un microorganismo o a un virus nos informa solamente de la presencia o no de esta infección en el paciente analizado. Esto último se conoce como PCR cualitativa. Sin embargo, si se monitoriza el proceso de amplificación de la secuencia en cuestión a tiempo real, podemos cuantificar la cantidad de material genético que está presente en la muestra. La Q-PCR en tiempo real nos posibilita no sólo conocer la presencia de la infección sino también cuantificar el número de copias existentes, convirtiéndose en instrumento crucial para la determinación de la carga viral. Por otra parte, la posibilidad de poder amplificar varias secuencias específicas de un mismo espécimen (multi-PCR) nos aporta una información completa de la presencia de la infección.

Nuevas indicaciones

Es evidente que esta herramienta, que en principio se entendió como otra más de la biología molecular, tiene un amplio espectro de aplicación en el diagnóstico. En el campo de la microbiología, la PCR está llamada a sustituir completamente a gran cantidad de los métodos actuales de detección de agentes patógenos. No sólo gana, por amplia diferencia, en cuanto a la posibilidad de detectar la presencia de microorganismos difíciles de cultivar; también facilita tener resultados fiables en un intervalo de tiempo corto -horas-, mientras que los cultivos necesitan días.

En la actualidad se han desarrollado ensayos de PCR para la detección de Listeria, Legionella, Borrelia, Leptospira, Chlamydia, Neisseria y Treponema, entre otros.

Los resultados obtenidos por PCR han demostrado correlacionar erfectamente con la información que aportan los cultivos, con la diferencia de que, para estos últimos, se tuvo que esperar unos siete días, mientras que los resultados de la PCR se obtuvieron en horas. Cabe destacar que la sensibilidad de esta técnica es mil veces mayor que la que tiene un cultivo. Otras aplicaciones interesantes, y cada vez más extendidas, son la determinación de la resistencia a antibióticos de bacterias aisladas de pacientes y la detección de parásitos tales como Toxoplasma, Trypanosoma y Cryptosporidium.

Cáncer y virus

En el diagnóstico del cáncer la aplicación de la PCR ha sido esencial para determinar la presencia de marcadores específicos del desarrollo de esta enfermedad, así como la aparición de polimorfismos que inducen eventos oncológicos. Un ejemplo claro lo constituyen los niveles de expresión de factores como HER-2 y la topo IIa, genes importantes en el desarrollo del cáncer de mama, fácilmente detectables por PCR en tiempo real. Sus niveles indican una mala prognosis para el paciente en cuestión. Por otra parte, la localización de mutaciones en genes como el p53 es otra de las aplicaciones de la PCR al diagnóstico en el campo de la oncología. Sin embargo, una de las áreas donde esta técnica ha tenido mayor impacto es en la detección y cuantificación de virus y retrovirus. Tres factores han contribuido a ello: son agentes patógenos con un material genético muy simple, el aislamiento de su ADN o ARN es sencillo y, por último, el diagnóstico por cultivo es difícil y laborioso.

Una larga lista de ensayos de PCR se ha establecido para detectar virus. En este apartado merecen una especial mención los retrovirus que provocan el sida, ya que la PCR ha contribuido a eliminar el periodo ventana en su detección. Los métodos más tradicionales, basados en la aparición de anticuerpos o la detección de proteínas del virus (Elisa o Western Blot), necesitan unos niveles de contaminación elevados o un período de incubación largo (de tres a seis meses desde la infección).

No obstante, con la PCR se puede reconocer su presencia transcurridas 48-72 horas de la contaminación, siendo más prudente esperar una semana para eliminar posibles falsos negativos. Por otra parte, la posibilidad que brinda la cuantificación de las copias existentes ayuda en el ajuste del tratamiento. La precisión de la PCR logra diferenciar la presencia de distintos subtipos de un mismo virus cuya “apariencia” es indistinguible por métodos más clásicos.

Otros campos de aplicación de esta técnica son las enfermedades neurodegenerativas y el diagnóstico prenatal. Mientras que en el primer grupo el uso de la PCR se circunscribe a la detección de polimorfismos que sirven para la clasificación de este tipo de enfermedades, en el caso del diagnóstico prenatal se aplica para identificar posibles fallos genéticos en los fetos. Recientemente se ha abierto una amplia gama de posibilidades para el diagnóstico no invasivo prenatal usando la PCR, debido a que se ha identificado la presencia de ADN fetal en la circulación de la madre, posibilitándose la extracción de material genético fetal desde el plasma materno.

La precisión y fiabilidad de esta técnica ha eliminado el antiguo temor que suscitaba la aparición de falsos positivos/negativos. Sus múltiples y muy variadas posibilidades nos hacen recomendar el estudio de las peculiaridades de cada diagnóstico donde se aplica la PCR, tendiendo otro puente de unión entre la biología molecular y el diagnóstico clínico.

Entrevista al Doctor Eduardo López Collazo publicada en Diario Médico, el Lunes, 4 de Septiembre de 2006